Русская Википедия:Переворот оснований ДНК

Содержание

Текст

Текст

Текст

Текст

Текст

Текст

Текст

Текст

Текст

Cartoon of DNA with a base flipped out

Двойная спираль ДНК с цитозиновым основанием, развернутым на 180°.

Переворот оснований ДНК, или переворот нуклеотидов, представляет собой механизм, в котором одиночное основание нуклеотида, или азотистое основание, вращается вне двойной спирали нуклеиновой кислоты. Это происходит, когда ферменту, обрабатывающему нуклеиновую кислоту, требуется доступ к основанию для выполнения работы с ним, например, для его вырезания для замены другим основанием во время репарации ДНК. Впервые он был обнаружен в 1994 году с помощью рентгеновской кристаллографии фермента метилтрансферазы, катализирующего метилирование цитозинового основания в ДНК. С тех пор было показано, что он используется различными ферментами во многих биологических процессах, таких как метилирование ДНК, различные механизмы восстановления ДНК и репликация ДНК. Это также может происходить в двойных спиралях РНК или в интермедиатах «ДНК:РНК», образующихся во время транскрипции РНК.

Переворот оснований ДНК происходит путем разрыва водородных связей между основаниями и отделения основания от его соседей. Это может происходить в результате активного процесса, когда фермент связывается с ДНК, а затем способствует вращению основания, или пассивного процесса, когда основание спонтанно вращается, и это состояние распознается и связывается ферментом. Его можно обнаружить с помощью рентгеновской кристаллографии, ЯМР-спектроскопии, флуоресцентной спектроскопии или гибридизационных зондов.

Открытие

Переворот оснований впервые наблюдался в 1994 году, когда исследователи Климасаускас, Кумар, Робертс и Ченг использовали рентгеновскую кристаллографию для наблюдения за промежуточной стадией химической реакции метилтрансферазы, связанной с ДНК. Метилтрансферазой, которую они использовали, была C5-цитозинметилтрансфераза из Haemophilus haemolyticus (далее по тексту M. HhaI). Этот фермент распознает специфическую последовательность ДНК (5'-GCGC-3') и метилирует первое цитозиновое основание последовательности в его положении С5. После кристаллизации комплекса M. HhaI-ДНК они увидели, что целевое цитозиновое основание полностью вывернуто из двойной спирали и расположено в активном центре M. HhaI. Он удерживался на месте благодаря многочисленным взаимодействиям между M. HhaI и ДНК.

Авторы предположили, что переворот оснований был механизмом, используемым многими другими ферментами, такими как хеликазы, ферменты рекомбинации, РНК-полимеразы, ДНК-полимеразы и топоизомеразы типа II. В дальнейшем было проведено много исследований, и было обнаружено, что переворот оснований является механизмом, используемым во многих биологических процессах, предложенных авторами.

Механизм

Model of interactions between DNA with flipped base and a methyltransferase

Модель Entamoeba histolytica DNMT2 демонстрирует основание, вывернутое из двойной спирали в активный центр метилтрансферазы.

Нуклеотиды ДНК удерживаются вместе водородными связями, которые относительно слабы и легко рвутся. Переворот основания происходит в миллисекундном масштабе путем разрыва водородных связей между основаниями и её отделения от соседей. Основание поворачивается относительно двойной спирали на 180 градусов, как правило, через большую бороздку в активный центр фермента. Это событие приводит к небольшим конформационным изменениям в остове ДНК, которые быстро стабилизируются усилением взаимодействий фермент-ДНК. Исследования профилей свободной энергии при перевороте оснований показали, что барьер свободной энергии для переворота может быть снижен на 17 ккал / моль для M.HhaI в закрытой конформации.

Существует два механизма переворота оснований ДНК: активный и пассивный. В активном механизме фермент связывается с ДНК, а затем активно вращает основание, в то время как в пассивном механизме поврежденное основание сначала спонтанно вращается, а затем распознается и связывается ферментом. Исследования продемонстрировали оба механизма: урацил-ДНК-гликозилаза следует пассивному механизму, а транспозаза Tn10 следует активному механизму.

Кроме того, исследования показали, что переключение оснований ДНК используется многими различными ферментами в различных биологических процессах, таких как метилирование ДНК, различных механизмах репарации ДНК, транскрипции РНК и репликации ДНК.

Биологические процессы

Модификация ДНК и восстановление

Model of uracil DNA glycosylase and flipped uracil residue

Остаток урацила выходит из двойной спирали ДНК и попадает в карман специфичности урацил-ДНК-гликозилазы.

ДНК может иметь мутации, которые вызывают повреждение основания в цепи ДНК. Чтобы гарантировать генетическую целостность ДНК, ферменты должны восстанавливать любые повреждения. Существует много типов репарации ДНК. В основе процесса эксцизионной репарации оснований используется переворачивание оснований для того чтобы перевернуть поврежденное основание из двойной спирали в активный центр гликозилазы, которая гидролизует гликозидную связь и удаляет основание. ДНК-гликозилазы взаимодействуют с ДНК, переворачивая основания для определения несоответствия. Пример эксцизионной репарации оснований происходит, когда цитозиновое основание дезаминируется и становится урациловым основанием. Это вызывает неправильную пару U:G, которая обнаруживается урациловой ДНК-гликозилазой . Основание урацила выбрасывается в активный карман гликозилазы, где оно удаляется из цепи ДНК. Переворот оснований используется для восстановления таких мутаций, как 8-оксогуанин (oxoG) и димеров тимина, созданных УФ-излучением.

Репликация, транскрипция и рекомбинация

Репликация ДНК и транскрипция РНК используют переворот оснований. ДНК-полимераза — фермент, осуществляющий репликацию. Его можно представить как руку, сжимающую одноцепочечную матрицу ДНК. Когда матрица проходит через область ладони полимеразы, основания матрицы выворачиваются из спирали и удаляются от сайта связывания dNTP. Во время транскрипции РНК-полимераза катализирует синтез РНК. Во время фазы инициации два основания в промоторе высвобождаются из спирали и помещаются в два кармана в РНК-полимеразе. Эти новые взаимодействия стабилизируют промотор и способствуют разделению или расплавлению нитей ДНК.

Переворот основания также происходит на последних стадиях рекомбинации. RecA — это белок, который способствует инвазии цепи во время гомологичной рекомбинации. Переворот оснований был предложен как механизм, с помощью которого RecA может позволить одной цепи распознавать гомологию в дуплексной ДНК. Другие исследования показывают, что он также участвует в рекомбинации V(D)J.

Метилирование ДНК

DNA methylation illustration

Молекула ДНК, метилированная по обеим цепям в центре цитозина.

Метилирование ДНК представляет собой процесс, при котором метильная группа добавляется либо к цитозину, либо к аденину. Этот процесс вызывает активацию или инактивацию экспрессии генов, что приводит к регуляции генов в эукариотических клетках. Известно также, что процесс метилирования ДНК участвует в некоторых типах образования рака. Чтобы произошла эта химическая модификация, необходимо, чтобы целевое основание вывернулось из двойной спирали ДНК, чтобы метилтрансферазы могли катализировать реакцию.

Распознавание мишени эндонуклеазами рестрикции

Эндонуклеазы рестрикции, также известные как ферменты рестрикции, представляют собой ферменты, которые расщепляют сахаро-фосфатный остов ДНК в определённых последовательностях нуклеотидов, которые обычно имеют длину от четырёх до шести нуклеотидов. Исследования, проведенные Хортоном и его коллегами, показали, что механизм, с помощью которого эти ферменты расщепляют ДНК, включает переворот оснований, а также изгибание ДНК и расширение малой бороздки. В 2006 году Хортон и его коллеги представили данные рентгеновской кристаллографии, показывающие, что эндонуклеаза рестрикции HinP1I использует переворот оснований для распознавания своей последовательности-мишени. Известно, что этот фермент расщепляет ДНК по палиндромной тетрануклеотидной последовательности G↓CGC.

Экспериментальные подходы к обнаружению

Рентгеновская кристаллография

X-ray crystallography workflow

Рабочий процесс для определения структуры молекулы с помощью рентгеновской кристаллографии

Рентгеновская кристаллография — это метод, который измеряет углы и интенсивности кристаллических атомов, чтобы определить атомную и молекулярную структуру интересующего кристалла. Затем кристаллографы могут создавать трехмерные изображения, на которых можно определить положение атомов, химических связей, а также другие важные характеристики. Климасаукас и его коллеги использовали эту технику для наблюдения первого явления переворота базы, в котором их экспериментальная процедура включала несколько этапов:

1. Очищение
2. Кристаллизация
3. Сбор данных
4. Определение и уточнение структуры

Во время очистки метилтрансфераза Haemophilus haemolyticus подвергалась сверхэкспрессии и очищалась с использованием стадии обратной экстракции с высоким содержанием соли для селективного растворения M.HhaI с последующей быстрой белковой жидкостной хроматографией (FPLC), как это было сделано ранее Кумаром и его коллегами. Авторы использовали анионообменную колонку Mono-Q для удаления небольшого количества белковых материалов и нежелательной ДНК перед стадией кристаллизации. После того, как M.HhaI был успешно очищен, образец был выращен с использованием метода, который смешивает раствор, содержащий комплекс, при температуре 16 °C и метод диффузии паров висячей капли для получения кристаллов. Затем авторы смогли собрать рентгеновские данные в соответствии с методом, использованным Ченгом и его коллегами в 1993 году. Этот метод включал измерение интенсивности дифракции на детекторе FAST, где время экспозиции для поворота на 0,1° составляло 5 или 10 секунд. Для определения и уточнения структуры Климасаукас и его коллеги использовали молекулярную замену уточненной структуры апо, описанную Ченгом и его коллегами в 1993 г., где поисковые модели X-PLOR, MERLOT и TRNSUM использовались для решения функций вращения и трансляции. Эта часть исследования включает использование различных программ и компьютерных алгоритмов для определения структуры и характеристик интересующего кристалла.

ЯМР-спектроскопия

ЯМР-спектроскопия — это метод, который на протяжении многих лет использовался для изучения важных динамических аспектов переворота оснований. Он позволяет исследователям определять физические и химические свойства атомов и других молекул, используя магнитные свойства атомных ядер. Кроме того, ЯМР может предоставить разнообразную информацию, включая структуру, состояние реакции, химическое окружение молекул и динамику. Во время эксперимента по открытию переворота основания ДНК исследователи использовали ЯМР-спектроскопию для исследования индуцированного ферментом переворота основания HhaI-метилтрансферазы. Чтобы выполнить этот эксперимент, два остатка 5-фторцитозина были включены в мишень и контрольное положение с ДНК-субстратом, чтобы можно было выполнить анализ химического сдвига ¹⁹F . После оценки анализа химического сдвига ¹⁹F был сделан вывод, что комплексы ДНК существуют с множественными формами целевого 5-фторцитозина вдоль пути переключения оснований.

Флуоресцентная спектроскопия

Флуоресцентная спектроскопия — это метод, который используется для анализа образца с использованием флуоресцентного зонда. Нуклеотиды ДНК сами по себе не являются хорошими кандидатами для этого метода, потому что они слабо излучают свет при световом возбуждении. Для обнаружения переворачивания базы необходим флуоресцентный маркер. 2-Аминопурин представляет собой основание, которое структурно похоже на аденин, но способное к флуоресценции при его отделении от дуплекса ДНК. Он обычно используется для обнаружения переворачивания основания и имеет возбуждение на уровне 305—320.нм и излучение при 370нм так, чтобы он хорошо отделялся от возбуждений белков и ДНК. Другими флуоресцентными зондами, используемыми для изучения переворота оснований ДНК, являются 6MAP (4-амино-6-метил-7(8H)-птеридон) и пирроло-C (3-[β-D-2-рибофуранозил]-6-метилпирроло [2,3-d]пиримидин-2(3H)-он) Флуоресцентная спектроскопия с временным разрешением также используется для получения более подробной картины степени переворота основания, а также конформационной динамики, происходящей во время переворота основания.

Гибридизационное зондирование

Гибридизационные зонды можно использовать для обнаружения переворачивания оснований. В этом методе используется молекула, которая имеет последовательность, комплементарную последовательности, которую вы хотите обнаружить, так что она связывается с одноцепочечной ДНК или РНК. Несколько зондов гибридизации использовались для обнаружения переворачивания оснований. Перманганат калия используется для обнаружения остатков тимина, которые были высвобождены цитозин-С5 и аденин-N6 метилтрансферазами. Хлорацетальдегид используется для обнаружения остатков цитозина, высвобождаемых ДНК-цитозин-5-метилтрансферазой HhaI (M. HhaI).

DNA showing a hybridization probe

Добавление гибридизационного зонда к молекуле ДНК

См. также

• Восстановление ДНК
• Эксцизионная репарация
• Репликация ДНК
• Транскрипция РНК
• Метилирование ДНК
• ДНК-метилтрансфераза
• Генетическая рекомбинация
• Гомологическая рекомбинация
• ДНК
• Эпигенетика
• Эпигеномика