Русская Википедия:Альтернативный сплайсинг
Альтернати́вный спла́йсинг — вариант сплайсинга матричных РНК (мРНК), при котором в ходе экспрессии гена на основе одного и того же первичного транскрипта (пре-мРНК) происходит образование нескольких зрелых мРНК. Структурные и функциональные различия образовавшихся транскриптов могут быть вызваны как выборочным включением в зрелую мРНК экзонов первичного транскрипта, так и сохранением в ней частей интронов[1][2]. Наиболее распространённая разновидность альтернативного сплайсинга предусматривает Шаблон:Нп5: отдельные экзоны транскрипта при определённых условиях могут быть как включены в зрелую мРНК, так и пропущены[3].
Белки, получаемые трансляцией таких мРНК, в результате имеют разные аминокислотные последовательности; таким образом, при альтернативном сплайсинге один транскрипт обеспечивает синтез нескольких белков. Широкое распространение такого сплайсинга у эукариот приводит к значительному увеличению разнообразия белков, закодированных в их геномах[4]. Например, организм человека синтезирует не менее чем 100 тысяч различных белков, в то время как число кодирующих их генов примерно 20 тысяч (при этом среди всех генов человека, которые содержат интроны, более 75 % выступают как матрицы для синтеза пре-мРНК, подвергаемых далее альтернативному сплайсингу)[1][2].
Образование альтернативно сплайсированных мРНК находится под контролем системы транс-действующих белков (Шаблон:Нп5), которые связываются с цис-сайтами первичного транскрипта. Среди факторов сплайсинга выделяют активаторы и репрессоры сплайсинга: первые способствуют использованию отдельных его сайтов, а вторые, наоборот, предотвращают их использование. Механизмы альтернативного сплайсинга очень разнообразны, знание «кода сплайсинга» создаёт возможность предсказывать результаты сплайсинга конкретного гена в тех или иных условиях[5][6].
Аномалии альтернативного сплайсинга нередко приводят к болезням; немало генетических заболеваний человека вызвано этими аномалиями[5]. Исследователи полагают, что аберрантный сплайсинг может способствовать развитию рака, причём показано, что при различных видах рака гены факторов сплайсинга часто мутируют, приводя к нарушению нормального хода сплайсинга[7][8][9][10]. Установлено также, что аномалии альтернативного сплайсинга вносят вклад в развитие резистентности организма к химиотерапии[11].
История изучения
Впервые альтернативный сплайсинг был описан в 1977 году у аденовирусов[12][13]. Было установлено, что аденовирус образует пять различных транскриптов в ранней стадии инфекционного цикла, до репликации вирусной ДНК, и ещё один после начала репликации ДНК; при этом образование ранних первичных транскриптов продолжается после начала репликации ДНК. Дополнительный одиночный транскрипт, образуемый на поздних стадиях инфекционного цикла, считывается с 5/6 аденовирусного генома размером 32 килобазы. Поздний транскрипт гораздо длиннее каждого из ранних вирусных транскриптов. Исследователи показали, что первичный транскрипт, образуемый аденовирусом типа 2 на поздних стадиях инфекции, подвергается сплайсингу разными способами, что приводит к образованию мРНК, кодирующих разные вирусные белки. Кроме того, первичный транскрипт содержит множество сайтов полиаденилирования, в результате чего у разных мРНК могут получаться разные 3'-концы[14][15][16].
В 1981 году альтернативный сплайсинг был описан у клеточного эукариотического гена. Было показано, что в клетках млекопитающих такой альтернативный сопровождает образование гормона кальцитонина. Первичный транскрипт гена кальцитонина содержит 6 экзонов; в зрелую мРНК, кодирующую кальцитонин, входят экзоны 1—4, и сигнал полиаденилирования находится в экзоне 4. У другой мРНК, образуемой из того же первичного транскрипта, при сплайсинге экзон 4 пропускается, и зрелая мРНК содержит экзоны 1—3, 5 и 6. Она кодирует белок, известный как Шаблон:Нп5 (Шаблон:Lang-en)[17][18]. В начале 1980-х годов был также открыт альтернативный сплайсинг в генах иммуноглобулинов млекопитающих[14][19].
Последующие исследования показали, что альтернативный сплайсинг распространён среди всех эукариот[3]. При этом количество изоформ белка, которые могут быть транслированы с одного гена, может быть весьма значительным. Так, подсчитано, что ген плодовой мушки Drosophila melanogaster, известный как Шаблон:Нп5, при независимом комбинировании в мРНК всех имеющихся экзонов потенциально может обеспечить синтез 38 016 изоформ[20].
Модели
Существует пять моделей альтернативного сплайсинга[3][4][5][21]Шаблон:Sfn:
- Пропуск экзона или кассетный экзон. В данном случае любой экзон может быть вырезан или включён в состав зрелой мРНК. Это — наиболее распространённая модель прохождения альтернативного сплайсинга у пре-мРНК млекопитающих, по некоторым подсчётам, более 38 % событий альтернативного сплайсинга у млекопитающих следует данной модели[22]).
- Взаимоисключающие экзоны. Из двух экзонов в зрелую мРНК включается только один, но не оба (данная модель сложнее остальных, поскольку предусматривает скоординированное протекание, по крайней мере, двух событий альтернативного сплайсинга[22]).
- Альтернативный донорный сайт. Используется альтернативный 5'-конец интрона (донорный сайт), так что меняется 3'-конец вышестоящего экзона (у млекопитающих данный механизм ответственен примерно за 8 % событий альтернативного сплайсинга[22]).
- Альтернативный акцепторный сайт. Используется альтернативный 3'-конец интрона (акцепторный сайт), так что меняется 5'-конец нижестоящего экзона (на этой модели основано примерно 18 % событий альтернативного сплайсинга у млекопитающих[22]).
- Удержание интрона. Последовательность может быть вырезана как интрон или оставлена в зрелой мРНК. Этот способ отличается от пропуска экзона, поскольку сохраняемая последовательность не окружена интронами. Если оставленный интрон попадает в кодирующую область, то он должен кодировать аминокислотную последовательность с такой же рамкой считывания, как и соседние экзоны. Если же он будет иметь другую рамку считывания или содержать стоп-кодон, белок будет нефункциональным. Это — самый редкий механизм альтернативного сплайсинга у млекопитающих (на него приходится примерно 3 % событий АС; в то же время, данный механизм достаточно широко распространён при онкологических заболеваниях, где он служит одним из механизмов инактивации генов-супрессоров опухолей[22])[21].
Кроме пяти основных моделей альтернативного сплайсинга, известны два способа получения нескольких белков с одного гена в результате использования множественных промоторов и множественных сайтов полиаденилирования. Однако, использование множественных промоторов относится, скорее, к регуляции транскрипции, чем к альтернативному сплайсингу. Начиная транскрипцию с разных точек, можно получить транскрипты с различающимися 5'-концевыми экзонами. С другой стороны, использование множественных сайтов полиаденилирования приводит к образованию разных 3'-концов у созревающих транскриптов. Оба этих механизма в сочетании с пятью моделями сплайсинга обеспечивают разнообразие мРНК, считываемых с одного и того же гена[3][5].
Один транскрипт способен подвергаться более чем одному типу альтернативного сплайсингаШаблон:Sfn. Рассмотренные выше модели хорошо описывают базовые механизмы сплайсинга, однако могут не подходить для сложных случаев. Например, на рисунке справа представлены три формы гена гиалуронидазы 3 мыши, полученные в ходе сплайсинга. Сравнение экзонов первой формы (зелёная) и второй (жёлтая) указывает, что интрон был сохранён в конечном транскрипте, а сравнение второй формы с третьей (синяя) показывает пропуск экзона[21].
Механизм
Общая схема сплайсинга
Пре-мРНК, транскрибируемая с ДНК, содержит как экзоны, так и интроны, причём число и длина интронов, создающих необходимый фон для альтернативного сплайсинга, у различных эукариот существенно варьирует. Так, среднее число интронов, приходящееся на один интрон-содержащий ген, у модельных организмов составляет: у дрозофилы Drosophila melanogaster — 2,5, у нематоды Caenorhabditis elegans — 4,2, у резуховидки Таля Arabidopsis thaliana — 4,8; у млекопитающих оно изменяется от 5,7 до 7,8[23]. В ходе сплайсинга экзоны должны быть оставлены в транскрипте, а интроны удалены. Регуляцию и выбор сайтов сплайсинга обеспечивают транс-действующие белки-активаторы и репрессоры сплайсинга, а также присутствующие в самой пре-мРНК цис-действующие элементы — энхансеры и сайленсеры сплайсинга[24].
Типичные эукариотические интроны содержат консенсусные последовательности; так, на 5'-конце каждого интрона присутствует динуклеотид GU, рядом с 3'-концом находится «точка ветвления», в которой всегда присутствует нуклеотид А, а расположенные вокруг него последовательности варьируются. У человека консенсусная последовательность вокруг точки ветвления yUnAy[25]. После точки ветвления расположен ряд пиримидинов (Шаблон:Нп5), а 3'-конец интрона выглядит как AG[5].
Сплайсинг пре-мРНК осуществляет РНК-белковый комплекс, известный как сплайсосома. В состав сплайсосомы входят Шаблон:Нп5 (snRNP), обозначаемые Шаблон:Нп5, Шаблон:Нп5, Шаблон:Нп5, Шаблон:Нп5 и Шаблон:Нп5 (рибонуклеотид U3 в сплайсинге мРНК не участвует)[22][26]. Рибонуклеотид U1 связывается с 5'-концевым динуклеотидом GU, а U2, при участии белковых факторов U2AF, связывается с точкой ветвления (на этой стадии комплекс называется сплайсосомный А-комплекс). Во время формирования А-комплекса определяются 5'- и 3'-границы удаляемого интрона, а также концы экзонов, которые должны быть оставлены[5] .
Далее с А-комплексом связывается комплекс U4, U5, U6. После этого U6 замещает U1, а U1 и U4 покидают комплекс. Оставшийся комплекс подвергается двум реакциям переэтерификации. В ходе первой реакции происходит отрезание 5'-конца интрона от вышележащего экзона и его присоединение в точке ветвления к нуклеотиду А с помощью 2',5'-фосфодиэфирной связи, в результате чего интрон принимает форму лассо. Вторая реакция обеспечивает отрезание 3'-конца интрона и соединение двух экзонов фосфодиэфирной связью; при этом интрон высвобождается и разрушается[3][22].
Регуляторные элементы и белки
Сплайсинг регулируется транс-действующими белками (активаторами и репрессорами) и соответствующими цис-регуляторными элементами (сайленсерами и энхансерами) на пре-мРНК. Впрочем, имеются данные, что во многих случаях действие фактора сплайсинга зависит от его положения: когда фактор сплайсинга связан с интронным энхансерным элементом, он действует как активатор сплайсинга, а когда связывается с регуляторным сайтом в экзоне, то действует как репрессор[24]. В регуляции сплайсинга принимает также участие вторичная структура пре-мРНК, которая обеспечивает эффективное сближение друг с другом двух регуляторных элементов или маскирует те последовательности, которые могли бы служить местами связывания факторов сплайсинга[27][28]. Вместе все эти элементы образуют «код сплайсинга», который определяет, как будет проходить сплайсинг в данных клеточных условиях[29][30].
Известны два типа цис-активирующих элементов в пре-мРНК, и им соответствуют транс-активирующие РНК-связывающие белки. Сайленсеры сплайсинга — это элементы, с которыми связываются белки-репрессоры сайленсинга, снижая при этом вероятность того, что по соседству будет находиться сайт сплайсинга. Местом размещения сайленсеров сплайсинга могут быть как интроны (интронные сайленсеры сплайсинга, ISS), так и экзоны (экзонные сайленсеры сплайсинга, ESS). Их нуклеотидные последовательности, как и связывающиеся с ними белки, весьма разнообразны. Большинство репрессоров сплайсинга являются Шаблон:Нп5 (hnRNP) — такими, как Шаблон:Нп5 и белок, связывающий полипиримидиновый тракт (PTB)[5][29].
С энхансерами сплайсинга связываются белки-активаторы сплайсинга, увеличивая эффективную вероятность того, что рядом будет находиться сайт сплайсинга. Их местом размещения также могут служить как интроны (интронные энхансеры сплайсинга, ISE), так и экзоны (экзонные энхансеры сплайсинга, ESE). Бо́льшая часть белков, связывающихся с ISE и ESE, относится к семейству белков Шаблон:Нп5 (регулирующим не только ход альтернативного сплайсинга, но и многие другие клеточные процессы[31]; первый из белков данного семейства, идентифицированный как фактор сплайсинга, был открыт в 1991 году[32]). Эти белки содержат мотивы, распознающие РНК, а также домены, обогащённые аргинином и серином[5][29].
Таким образом, факторы сплайсинга действуют взаимозависимо, причём результаты их действия зависят также от окружения[30]. Наличие определённых цис-регуляторных последовательностей РНК способно как увеличить вероятность того, что рядом будет находиться сайт сплайсинга, так и уменьшить эту вероятность — в зависимости от контекста. Например, некоторые такие элементы влияют на сплайсинг только при наличии рядом с ними других вполне определённых элементов. Кроме того, цис-регуляторные элементы могут давать разный эффект при экспрессии в клетке определённых белков. Адаптивное значение энхансеров и сайленсеров сплайсинга подтверждают работы, показывающие, что в человеческих генах мутации, приводящие к образованию новых сайленсеров или разрушению старых энхансеров, подвержены строгому отбору[33][34].
Примеры
Пропуск экзона: ген dsx дрозофилы
Пре-мРНК гена Шаблон:Нп5 дрозофилы D. melanogaster содержит 6 экзонов. У самцов в зрелую мРНК входят экзоны 1, 2, 3, 5, 6, и они кодируют белок, который функционирует как регулятор транскрипции в развитии по мужскому типу. У самок в зрелую мРНК входят экзоны 1, 2, 3 и 4, причём экзон 4 содержит сигнал полиаденилирования, по которому мРНК разрезается. Получившийся белок функционирует как регулятор транскрипции в развитии по женскому типу[35].
В описанном примере имеет место альтернативный сплайсинг по типу пропуска экзона. Интрон, лежащий выше экзона 4, содержит полипиримидиновый тракт, который не вполне удовлетворяет консенсусной последовательности сплайсинга, поэтому белки U2AF в отсутствие активаторов сплайсинга связываются с ним плохо. По этой причине у самцов этот 3'-акцепторный сайт сплайсинга не используется. У самок, однако, присутствует активатор сплайсинга Transformer (Tra). Этот белок связывается с SR-белком Tra2 (который образуется у обоих полов и связывается с ESE в экзоне 4) и совместно с ещё одним SR-белком, dsxRE, формирует комплекс, который содействует связыванию белков U2AF со слабым пиримидиновым трактом. U2 рекрутируется к соответствующей точке ветвления, и в результате происходит включение экзона 4 в состав зрелой мРНК[35][36].
Альтернативные акцепторные сайты: Transformer дрозофилы
Пре-мРНК гена Transformer (Tra) D. melanogaster подвергаются альтернативному сплайсингу по модели альтернативных акцепторных сайтов. Ген Tra кодирует белок, экспрессия которого имеет место только у самок. Первичный транскрипт этого гена содержит интрон с двумя возможными акцепторными сайтами. У самцов задействован вышележащий акцепторный сайт, благодаря чему происходит включение в мРНК удлинённого варианта экзона 2, содержащего преждевременный стоп-кодон; поэтому у самцов образуется укороченный неактивный белок. У самок же образуется полноценный белок, играющий ключевую роль в определении пола и известный как Sex lethal (Sxl). Белок Sxl является репрессором сплайсинга и, связываясь с ISS в РНК-транскрипте Tra рядом с вышележащим акцепторным сайтом, предотвращает связывание белка U2AF с полипиримидиновым трактом; в результате сплайсосома связывается с нижележащим акцепторным сайтом, что приводит к удалению преждевременного стоп-кодона. Полученная мРНК кодирует белок Tra, который сам выступает регулятором альтернативного сплайсинга других связанных с полом генов (см. выше пример гена dsx)[3].
Альтернативный сплайсинг рецептора Fas
В результате альтернативного сплайсинга происходит синтез множества изоформ рецептора Шаблон:Нп5. У человека две нормальные изоформы данного рецептора образуются по механизму пропуска экзона. мРНК, содержащая 6 экзонов, кодирует мембраносвязанную форму рецептора Fas, которая стимулирует апоптоз. Повышенное образование рецептора Fas в клетках, постоянно подвергающихся воздействию солнечного света, и отсутствие этого рецептора в клетках рака кожи свидетельствуют о том, что рассматриваемый механизм играет важную роль в элиминации клеток, вставших на путь превращения в раковые[37]. При пропуске экзона 6 образуется водорастворимая изоформа белка Fas, которая стимулировать апоптоз неспособна. Выбор между вставкой или пропуском экзона зависит от действия двух белков-антагонистов: Шаблон:Нп5 и PTB.
Донорный сайт, расположенный на 5'-конце интрона, следующим после экзона 6 в пре-мРНК, плохо согласуется с консенсусной последовательностью сплайсинга, и не всегда связывается с snRNP U1[5]. Если связывания U1 не происходит, экзон 6 пропускается (картинка а на рисунке справа). Связывание белка TIA-1 с интронным энхансером сплайсинга стабилизирует связывание U1. Образующийся на 5'-конце интрона донорный сайт помогает связываться фактору сплайсинга U2AF с 3'-сайтом сплайсинга, расположенным выше экзона, хотя механизм этого ещё не понятен (картинка b на рисунке справа)[38]. Экзон 6 содержит обогащённый пиримидинами сайленсер сплайсинга (ure6), с которым может связываться PTB. Если связывание PTB имеет место, то донорный сайт на 5'-конце интрона не способствует связыванию фактора U2AF, и экзон пропускается (картинка с на рисунке справа).
Описанный выше механизм является примером определения экзона при сплайсинге. Сплайсосома собирается в области интрона, и snRNP укладывают РНК так, что 5'- и 3'-концы интрона соединяются. Однако в описанном выше случае происходит также взаимодействие концов экзона. В этом случае взаимодействия, определяющие границы экзона, необходимы для связывания коровых факторов сплайсинга до сборки сплайсосомы на границах фланкирующих интронов[38].
Конкуренция репрессора и активатора: экзон 2 гена tat ВИЧ-1
ВИЧ — ретровирус, являющийся причиной развития СПИДа — образует единственную пре-мРНК, из которой далее посредством альтернативного сплайсинга образуется более 40 различных мРНК[39]. Равновесие между сплайсированными по-разному транскриптами обеспечивает образование мРНК, кодирующих все белки, необходимые для репликации вируса[40]. Один из по-разному сплайсированных транскриптов содержит транскрипт гена Шаблон:Нп5, у которого экзон 2 является кассетным, то есть может быть либо включён в итоговый транскрипт, либо не включён. Включение этого экзона регулируют репрессор сплайсинга hnRNP A1 и SR-белок SC35. В экзоне 2 имеет место перекрывание сайленсерной последовательности (ESS) и энхансерной последовательности (ESE) перекрываются. Если с ESS связывается репрессор А1, то он запускает кооперативное связывание молекул А1, закрывая 5'-концевой донорный сайт выше экзона 2 и препятствуя связыванию U2AF35 с полипиримидиновым трактом. Если SC35 связывается с ESE, то он препятствует связыванию А1, и 5'-донорный сайт остаётся доступным для сплайсосомы. Конкуренция между репрессором и активатором приводит к образованию РНК, соответственно содержащей или не содержащей экзон 2[39].
Адаптивное значение
Альтернативный сплайсинг — это одно из исключений из правила, по которому одному гену соответствует один белок (гипотеза «один ген — один фермент»)[41]. Корректнее было бы сказать: «один ген — много полипептидов». Внешняя информация нужна для того, чтобы решить, какой именно полипептид образовать с данной мРНК. Поскольку способы регуляции наследуются, то это открывает мутациям новый путь к изменению экспрессии генов[9].
Предполагается, что для эукариот альтернативный сплайсинг — очень важный шаг на пути к повышению эффективности экспрессии генов, поскольку он даёт возможность хранить информацию более экономно. Один ген может давать начало нескольким белкам, а не одному, поэтому одно и то же разнообразие протеома можно получить с генома существенно меньшего размера[3]. Это также обеспечивает эволюционную гибкость. Единственная точечная мутация может привести к включению или исключению экзона из транскрипта, благодаря чему может быть получена новая изоформа белка без потери его основной формы[3]. Обнаружены действительно неупорядоченные регионы, которые содержат много неконститутивных экзонов, поэтому изоформы белка могут выполнять новые функции, изменяя функциональные модули в этих местах[42][43][44]. Сравнительные оценки показывают, что возникновение альтернативного сплайсинга в ходе эволюции предшествовало появлению многоклеточности; предполагают, что альтернативный сплайсинг был одним из средств, обеспечивающих возникновение многоклеточных организмов[45].
Исследования в рамках проекта «Геном человека», а также других проектов по секвенированию геномов показали, что геном человека всего лишь на 30 % больше генома нематоды Caenorhabditis elegans и всего лишь в два раза больше, чем у плодовой мушки Drosophila melanogaster. Эти данные наводят на мысль, что сложность человека и позвоночных животных вообще может быть связана с более активным, по сравнению с беспозвоночными, использованию альтернативного сплайсинга[46][47]. Однако дальнейшее изучение геномных последовательностей человека, мыши, крысы, коровы, D. melanogaster, C. elegans и растения Arabidopsis thaliana показало, что между человеком и другими эукариотами не наблюдается значительной разницы в использовании альтернативного сплайсинга[48]. Имеются, впрочем, сведения, что полученные данные представляют собой артефакт, связанный с неравномерным включением в сравнительный анализ последовательностей комплементарной ДНК, взятых у различных организмов. При сравнении частот использования альтернативного сплайсинга для случайных выборок генов, полученных от сравниваемых организмов, оказалось, что у позвоночных альтернативный сплайсинг всё же встречается чаще, чем у беспозвоночных[49].
Клиническое значение
Изменения в аппарате процессинга РНК могут приводить к нарушениям сплайсинга многих транскриптов, а однонуклеотидные замены в сайтах сплайсинга или цис-регуляторных сайтах сплайсинга приводят к различиям в сплайсинге одного и того же гена, как и при сплайсинге транскрипта мутировавшего гена. В работе 2005 года было показано, что свыше 60 % мутаций, приводящих к развитию болезней, влияют не на саму кодирующую последовательность, а на сплайсинг[50]. Показано также, что примерно треть наследственных заболеваний связана с нарушениями сплайсинга[24].
Аномально сплайсированные мРНК встречаются в заметной доле раковых клеток[7][8][10]. Анализ RNA-Seq и протеомов показал выраженные различия в экспрессии сплайсинговых изоформ тех белков, которые участвуют в сигнальных путях, связанных с развитием рака[51]. Неизвестно, влияют ли нарушения сплайсинга на развития рака напрямую, или же они являются следствием поломки клеточных процессов в связи с переходом к раковому росту. Отмечено, что при некоторых видах рака — таких, как рак толстой кишки или рак простаты, количество ошибок в сплайсинге у разных пациентов значительно варьировало; данный феномен назвали транскриптомной нестабильностью[52][53].
Кроме этого, было показано, что транскриптомная нестабильность связана с пониженной экспрессией генов факторов сплайсинга. Действительно, в общем случае в раковых клетках альтернативный сплайсинг используется меньше, чем у нормальных клеток, причём модели сплайсинга тоже различаются. Так, в раковых клетках сохранение интрона происходит чаще, чем в нормальных клетках, а пропуск экзона — реже. Особенности сплайсинга в раковых клетках могут быть связаны с высокой частотой соматических мутаций в генах факторов сплайсинга, а некоторые особенности могут быть обусловлены изменениями в фосфорилировании транс-регуляторных факторов сплайсинга[54][9]. Некоторые особенности сплайсинга могут быть связаны с изменением относительного количества его факторов; например, в клетках рака груди наблюдаются повышенные уровни фактора сплайсинга Шаблон:Нп5[55]. В одном исследовании было показано, что относительно небольшая доля (383 из 26000) вариантов альтернативного сплайсинга в раковых клетках встречалась значительно чаще, чем в нормальных; отсюда следует, что существует ограниченное количество генов, аберрантный сплайсинг которых ведёт к развитию опухоли[56]. Считается, однако, что губительное действие нарушенного сплайсинга сдерживается особым клеточным посттранскрипционным механизмом контроля — нонсенс-опосредованным распадом[57].
Примером гена, специфический вариант сплайсинга которого связан у человека с развитием рака, служит один из генов DNMT. Три гена DNMT кодируют ферменты, которые добавляют метильные группы к ДНК, и модификация данных генов часто имеет регуляторные эффекты. Несколько аномально сплайсированных мРНК гена Шаблон:Нп5 было найдено в опухолях и клетках раковых Шаблон:Нп5. Экспрессия двух из этих мРНК вызывала изменения в метилировании ДНК в данных клетках. Клетки с одной ненормальной мРНК росли вдвое быстрее, чем контрольные клетки, поэтому обнаруженные мРНК связывают с развитием рака[9].
Другим примером может служить протоонкоген Ron (MST1R). Важным свойством раковых клеток является их способность мигрировать (метастазировать) в нормальные ткани и нарушать их работу. Образование аномально сплайсированной мРНК Ron было связано с повышенными уровнями SF2/ASF в клетках рака груди. Ненормальная изоформа Ron, транслированная с этой мРНК, увеличивала подвижность клеток[55].
Сверхэкспрессия укороченного варианта белка Шаблон:Нп5 — ΔFosB — в специфической популяции нейронов прилежащего ядра лежит в основе возникновения и поддержания привыкания к наркотикам и естественному вознаграждению (Шаблон:Lang-en)[58][59][60][61].
Недавние исследования показывают на роль структуры хроматина и модификаций гистонов в регуляции альтернативного сплайсинга. Поэтому эпигенетические факторы могут влиять не только на экспрессию генов, но и на их сплайсинг[62].
Полногеномный анализ
Полногеномный анализ альтернативного сплайсинга — сложная задача. Обычно альтернативно сплайсированные транскрипты обнаруживают при сравнении Шаблон:Нп5 (Шаблон:Lang-en). Большинство Шаблон:Нп5 собраны из очень ограниченного числа тканей, поэтому тканеспецифичные транскрипты ранее не были учтены. Однако появились высокопроизводительные методы для изучения сплайсинга — такие, как ДНК-микрочипы и Шаблон:Нп5 (Шаблон:Lang-en). Эти методы могут быть использованы для поиска полиморфизмов и мутаций, расположенных в тех элементов сплайсинга, которые влияют на связывание белков, или в их ближайшей окрестности. Сочетая данные методы с такими приёмами исследования сплайсинга, как in vitro анализ репортерных генов, можно изучать влияние полиморфизмов и мутаций на сплайсинг пре-мРНК[24][29][63].
При анализе с помощью микрочипов используют фрагменты ДНК, являющиеся отдельными экзонами (такие, как микрочип Шаблон:Нп5) или границами между экзонами. Затем в микрочип добавляют меченую кДНК из интересующей ткани. Эта пробная кДНК комплементарно связывается с фрагментами ДНК, уже находящимися в микрочипе. Благодаря данному методу можно выявить присутствие определённых альтернативно сплайсированных мРНК[64].
Метод CLIP (Шаблон:Lang-en — образование поперечных сшивок и иммунопреципитация) использует УФ-излучение для образования сшивок между белками и РНК, подвергающихся сплайсингу. Затем транс-действующие регуляторные белки сплайсинга осаждаются при помощи специальных антител. Когда РНК, связанную с белком, изолируют и клонируют, то определяется последовательность РНК, связанная с регуляторным белком[6]. Использование репортерных генов позволяет выявить белки сплайсинга, участвующие в специфичных случаях альтернативного сплайсинга: в зависимости от того, каким образом прошёл сплайсинг, репортёрный ген будет давать начало двум разным флуоресцентным белкам. Данный метод был использован для выделения мутантов с нарушенным сплайсингом и выявления регуляторных белков сплайсинга, инактивированных у этих мутантов[6].
См. также
Примечания
Литература
Ссылки
Шаблон:Посттранскрипционные модификации
- ↑ 1,0 1,1 Шаблон:Cite doi
- ↑ 2,0 2,1 Шаблон:Статья
- ↑ 3,0 3,1 3,2 3,3 3,4 3,5 3,6 3,7 Шаблон:Cite pmid
- ↑ 4,0 4,1 Шаблон:Cite pmid
- ↑ 5,0 5,1 5,2 5,3 5,4 5,5 5,6 5,7 5,8 5,9 Шаблон:Cite pmid
- ↑ 6,0 6,1 6,2 Шаблон:Cite pmid
- ↑ 7,0 7,1 Шаблон:Cite doi
- ↑ 8,0 8,1 Шаблон:Cite pmid
- ↑ 9,0 9,1 9,2 9,3 Шаблон:Cite pmid
- ↑ 10,0 10,1 Шаблон:Cite pmid
- ↑ Шаблон:Cite pmid
- ↑ Шаблон:Cite pmid
- ↑ Шаблон:Cite pmid
- ↑ 14,0 14,1 Шаблон:Cite pmid
- ↑ Шаблон:Cite pmid
- ↑ Шаблон:Cite pmid
- ↑ Шаблон:Cite pmid
- ↑ Шаблон:Cite pmid
- ↑ Шаблон:Cite pmid
- ↑ Шаблон:Cite pmid
- ↑ 21,0 21,1 21,2 21,3 Шаблон:Cite pmid
- ↑ 22,0 22,1 22,2 22,3 22,4 22,5 22,6 Шаблон:Cite pmid
- ↑ Шаблон:Cite doi
- ↑ 24,0 24,1 24,2 24,3 Шаблон:Cite pmid
- ↑ Шаблон:Cite pmid
- ↑ Шаблон:Книга
- ↑ Шаблон:Cite pmid
- ↑ Шаблон:Cite pmid
- ↑ 29,0 29,1 29,2 29,3 Шаблон:Cite pmid
- ↑ 30,0 30,1 Шаблон:Cite pmid
- ↑ Шаблон:Cite pmid
- ↑ Шаблон:Cite pmid
- ↑ Шаблон:Cite pmid
- ↑ Шаблон:Cite pmid
- ↑ 35,0 35,1 Шаблон:Cite pmid
- ↑ Шаблон:Cite pmid
- ↑ Шаблон:Cite pmid
- ↑ 38,0 38,1 Шаблон:Cite pmid
- ↑ 39,0 39,1 Шаблон:Cite pmid
- ↑ Шаблон:Cite pmid
- ↑ Шаблон:Cite web
- ↑ Шаблон:Cite pmid
- ↑ Шаблон:Cite pmid
- ↑ Шаблон:Cite pmid
- ↑ Шаблон:Cite pmid
- ↑ Шаблон:Cite pmid
- ↑ Шаблон:Cite pmid
- ↑ Шаблон:Cite pmid
- ↑ Шаблон:Cite pmid
- ↑ Шаблон:Cite pmid
- ↑ Шаблон:Cite pmid
- ↑ Шаблон:Cite pmid
- ↑ Шаблон:Cite pmid
- ↑ Шаблон:Cite pmid
- ↑ 55,0 55,1 Шаблон:Cite pmid
- ↑ Шаблон:Cite pmid
- ↑ Шаблон:Cite pmid
- ↑ Шаблон:Cite pmid
- ↑ Шаблон:Cite pmid
- ↑ Шаблон:Cite pmid
- ↑ Шаблон:Cite pmid
- ↑ Шаблон:Cite pmid
- ↑ Шаблон:Cite pmid
- ↑ Шаблон:Cite pmid
