Русская Википедия:Морфолиновые олигонуклеотиды

Фрагмент гетеродуплекса морфолинового олигонуклеотида и РНК

Морфоли́новые олигонуклеоти́дыШаблон:Sfn^[1]^[2], или морфоли́новые олигоме́ры^[3] (Шаблон:Lang-en) — синтетические олигонуклеотиды, использующиеся в молекулярной биологии для изменения экспрессии генов. Основу молекулярной структуры морфолинового олигонуклеотида составляют метиленморфолиновые кольца и фосфородиамидатные связи. Морфолиновые олигонуклеотиды блокируют доступ других молекул к небольшим (длиной около 25 нуклеотидов) специфическим последовательностям за счёт комплементарного спаривания с соответствующей РНК. Морфолиновые олигонуклеотиды служат исследовательскими инструментами в обратной генетикe для нокдауна гена.

Нокдаун гена заключается в предотвращении синтеза клеткой соответствующего белка^[4]. Морфолиновые олигонуклеотиды также могут влиять на сплайсинг пре-мРНК^[5]. Нокдаун гена является мощным средством для изучения функции конкретного гена. Аналогичным образом, вырезание специфического экзона из транскрипта позволяет определить функции, выполняемые соответствующими аминокислотными остатками белка, а иногда приводит к полной инактивации белка. Морфолиновые олигонуклеотиды используются в изучении многих модельных организмов, в том числе мышей, данио-рерио, лягушек и морских ежей^[6].

Разрабатываются пути применения морфолиновых олигонуклеотидов в медицине против патогенных организмов (бактерий^[7] и вирусов^[8]), а также для ослабления проявления генетических заболеваний^[9].

Структура

Морфолиновые олигонуклеотиды — это синтетические молекулы, представляющие собой измененные нуклеиновые кислоты^[10]. Они, как правило, имеют длину 25 нуклеотидов и комплементарно связываются с соответствующими последовательностями РНК за счёт спаривания оснований. Морфолиновые олигонуклеотиды имеют обычные азотистые основания, которые вместо дезоксирибозы соединены с кольцами морфолина, а в связи отдельных нуклеотидов участвуют не фосфатные, а фосфородиамидатные группы. Замена отрицательно заряженных фосфатных групп незаряженной фосфородиамидатной группой устраняет ионизацию при физиологических значениях рН, так что в живых клетках эти молекулы не заряжены. Вся молекула морфолинового олигонуклеотида состоит из таких изменённых нуклеотидов^[10].

Функции

Шаблон:Кратное изображение Морфолиновые олигонуклеотиды не вызывают деградации своей РНК-мишени, в отличие от многих антисмысловых молекул (например, малых интерферирующих РНК и Шаблон:Нп5). Вместо этого они выступают в роли «пространственных блокаторов», связываясь с последовательностью-мишенью и физически не давая другим молекулам связаться с этой РНК^[4]. Морфолиновые олигонуклеотиды часто используются для изучения роли специфических мРНК в развивающемся зародыше. Эмбриологи инъецируют их в яйца или зародыши данио-рерио^[11], шпорцевой лягушки^[12], морских ежей^[13] и рыбы Fundulus heteroclitus или доставляют эти молекулы путём электропорации в зародыши курицы на более поздних стадиях развития^[14]; обработанные таким образом зародыши называют морфантами. При наличии в цитозоле правильных систем доставки морфолиновых олигонуклеотидов могут быть эффективными и в культурах клеток^[15]^[16].

Блокирование трансляции

Связываясь с 5'-нетранслируемой областью мРНК, морфолиновые олигонуклеотиды могут мешать рибосоме в комплексе с Шаблон:Нп5 двигаться от кэпа к старт-кодону. Это предотвращает трансляцию кодирующей области транскрипта-мишени (нокдаун гена). Такой приём очень удобен, когда исследователь хочет определить функцию конкретного белка; по эффектам, оказываемым нокдауном гена на клетку или организм, судят о функции белка. Некоторые морфолиновые олигонуклеотиды блокируют экспрессию столь эффективно, что после деградации белка, синтезированного до введения олигонуклеотидов, этот белок становится неопределимым при помощи вестерн-блоттинга^[17].

Изменение сплайсинга пре-мРНК

Морфолиновые олигонуклеотиды могут вмешиваться в процессинг пре-мРНК следующими способами:

предотвращая связывание направляющих сплайсинг малых ядерных рибонуклеопротеинов (Шаблон:Нп5) со своими мишенями на границах интронов в пре-мРНК;
блокируя остаток аденина, осуществляет нуклеофильную атаку в ходе сплайсинга и образует структуру лассо;
мешая связыванию регуляторных белков сплайсинга, таких как сайленсеры^[18] и Шаблон:Нп5^[19].

Предотвращение связывания рибонуклеопротеинов Шаблон:Нп5 (в сайте-доноре) или Шаблон:Нп5/Шаблон:Нп5 (в Шаблон:Нп5 или сайте-акцепторе) может привести к модифицированному сплайсингу, при котором из зрелой мРНК исключаются экзоны. Воздействие на другие сайты сплайсинга приводит к включению интронов в зрелую мРНК, в то время как активация скрытых сайтов сплайсинга может приводит и к включениям, и к исключениям^[20]. Морфолиновые олигонуклеотиды могут также блокировать мишени snRNP Шаблон:Нп5/Шаблон:Нп5^[21]. Изменения в сплайсинге удобно отслеживать при помощи ПЦР с обратной транскрипцией (RT-PCR) и электрофореза (при электрофорезе продуктов RT-PCR наблюдается смещение полос в геле)^[5].

Другие применения

Морфолиновые олигонуклеотиды использовались для блокировки активности микроРНК^[22]^[23], а также их созревания^[24]. Морфолиновые олигонуклеотиды, меченные флуоресцеином, в сочетании с антителами, специфичными к флуоресцеину, могут использоваться в качестве проб Шаблон:Нп5 с микроРНК^[25]. Кроме того, они могут блокировать активность рибозимов^[26], а также функционирование snRNP U2 и U12^[27]. Морфолиновые олигонуклеотиды, нацеленные на «оголённые» последовательности мРНК в пределах кодирующей области, могут вызывать Шаблон:Нп5 при трансляции^[28]. Они также могут блокировать редактирование РНК. Эффективность морфолиновых олигонуклеотидов по отношению ко многим мишеням делает их универсальным средством для подавления взаимодействия белков или нуклеиновых кислот с мРНК^[29].

Специфичность, стабильность и не-антисмысловые эффекты

Морфолиновые олигонуклеотиды стали стандартным инструментом для нокдауна генов в эмбриональных системах животных, в которых экспрессируется больше генов, чем во взрослых клетках. После инъекции морфолинового олигонуклеотида в зародыши лягушки или рыбы на стадии одной или нескольких клеток наибольший эффект проявляется к пятому дню^[30], когда большая часть органогенеза и дифференцировки клеток и тканей уже позади; наблюдаемые фенотипы соответствуют нокауту определённого гена. Шаблон:Нп5 нуклеотиды, не нацеленные на какие-либо последовательности, как правило, не вызывают изменений в фенотипе зародыша, подтверждая, что морфолиновые олигонуклеотиды действуют специфично к последовательностям и, как правило, не имеют не-антисмысловых эффектов. Дозу, необходимую для нокдауна гена, можно сократить, одновременно вводя несколько морфолиновых олигонуклеотидов, нацеленных на одну и ту же мРНК; этот приём позволяет сократить или вовсе исключить зависимые от дозы взаимодействия олигонуклеотидов с РНК, не являющимися непосредственными мишенями^[31].

В экспериментах по «спасению» мРНК у зародышей часто удавалось вернуть фенотип дикого типа. В ходе этих экспериментов морфолиновый олигонуклеотид вводится в клетку вместе с мРНК, кодирующей тот белок, на нокдаун которого этот олигонуклеотид и направлен. Однако вводимая мРНК имеет изменённую 5'-нетранслируемую область, а потому не имеет последовательности-мишени для морфолинового олигонуклеотида, но её кодирующая область сохранена и с неё синтезируется интересующий белок. Трансляция с мРНК-«спасателя» восстанавливает образование белка, остановленное морфолиновым олигонуклеотидом. Спасательная мРНК не вызывает фенотипических отклонений, так как не действует на экспрессию генов, не являющихся мишенью введенного олигонуклеотида, поэтому возврат к фенотипу дикого типа служит ещё одним доказательством специфичности морфолиновых олигонуклеотидов по отношению к последовательности^[30].

Из-за совершенно неестественного химического строения морфолиновые олигонуклеотиды не распознаются клеточными белками. Нуклеазы их не разрушают^[32], поэтому они не разрушаются ни в клетках, ни в плазме крови^[33]. Морфолиновые олигонуклеотиды не активируют Toll-подобные рецепторы, а потому не запускают врождённый иммунный ответ, выражающийся, в частности, в образовании интерферона или в NF-κB-опосредованном воспалении^[34].

До 18 % морфолиновых олигонуклеотидов вызывают не связанные с исходными мишенями фенотипы, в частности, смерть клеток центральной нервной системы и сомитов у зародышей данио-рерио^[35]. Было показано, что большая часть этих эффектов связана с активацией p53-опосредованного апоптоза; их можно подавить, одновременно вводя экспериментальный морфолиновый олигонуклеотид и его анти-p53-аналог. Более того, вызванную морфолиновым олигонуклеотидом активацию p53-опосредованного апоптоза удалось повторить с использованием других антисмысловых структур, что говорит в пользу того, что p53-опосредованный апоптоз может быть вызван утратой белка-мишени и не зависит от типа олигонуклеотида, используемого для нокдауна^[36].

Морфолиновые олигонуклеотиды следует использовать с осторожностью из-за их потенциальных эффектов вне белка-мишени. Для проверки того, является ли наблюдаемый фенотип морфанта результатом нокдауна задуманного гена или же он вызван взаимодействием с РНК, не являющейся непосредственной мишенью введенного олигонуклеотида, можно провести второй эксперимент. Этот эксперимент заключается в повторении фенотипа (фенокопировании) морфанта с использованием другого морфолинового олигонуклеотида, нацеленного на ту же мишень, но не перекрывающегося с первым олигонуклеотидом^[30].

Доставка

Для того, чтобы морфолиновый олигонуклеотид мог подействовать, он должен попасть в цитозоль клетки и преодолеть клеточную мембрану. После попадания в цитозоль он начинает свободно диффундировать между цитозолем и ядром, как было показано в экспериментах, при которых введение морфолинового нуклеотида в цитозоль клетки изменяло сплайсинг в ядре^[5]. Для доставки морфолинового олигонуклеотида в зародыши, клетки культуры или клетки взрослых животных используются различные методы.

Для доставки в зародыши, как правило, используют Шаблон:Нп5, причём введение олигонуклеотидов обычно осуществляют на стадии одной или нескольких клеток^[37]. Альтернативный метод для доставки морфолиновых олигонуклеотидов в эмбрионы — электропорация, которая позволяет доставить их в ткани на более поздних стадиях развития зародыша^[38].

Наиболее распространённые методы для доставки морфолиновых олигонуклеотидов в клетки культуры — использование эндопортерного пептида (Шаблон:Lang-en), который вызывает высвобождение морфолиновых олигонуклеотидов из эндосом^[16]; система специальной доставки (Шаблон:Lang-en), использующая гетеродуплекс ДНК с морфолиновым олигонуклеотидом и Шаблон:Нп5 Шаблон:Нп5 в качестве реагента доставки (больше коммерчески недоступна)^[15]; электропорация^[39]; метод соскоба-загрузки (Шаблон:Lang-en)^[40]. В 2015 году была описана транс-активирующая амфипатическая система доставки, основанная на ДНК, которая предназначена для удобной доставки незаряженных нуклеиновых кислот, имеющих поли(А)-хвост, таких как пептидо-нуклеиновые кислоты и морфолиновые олигонуклеотиды^[41].

Доставка морфолиновых олигонуклеотидов в ткани взрослых животных затруднительна, хотя разработано несколько систем, позволяющих доставить в ткани немодифицированные морфолиновые олигонуклеотиды (в частности, в от природы слабые мышечные клетки при мышечной дистрофии Дюшена^[42] или в клетки сосудистого эндотелия, подвергающиеся стрессу при Шаблон:Нп5^[43]). Хотя морфолиновые олигонуклеотиды эффективно проходят через межклеточные промежутки в тканях, доставка их в клетки сложна. Системная доставка в клетки многих типов может быть осуществлена при помощи морфолиновых олигонуклеотидов, ковалентно связанных с Шаблон:Нп5 (Шаблон:Lang-en), и, в то время как токсичный эффект оказывают средние дозы связанных пептидов^[44]^[45], в условиях in vivo удалось добиться эффективной доставки морфолиновых олигонуклеотидов при дозах пептидов ниже токсичных^[8]^[46]. Октагуанидиновый дендример, прикреплённый к концу морфолинового олигонуклеотида (т. н. Vivo-Morpholino), обеспечивает его доставку из крови в цитозоль при систематическом введении во взрослого животного^[47]^[48].

Медицинское значение

Морфолиновые олигонуклеотиды, способные к эффективной доставке (такие как связанные с пептидами морфолиновые олигонуклеотиды и Vivo-Morpholino), могут быть перспективными средствами для лечения вирусных и генетических заболеваний^[49]. Например, Шаблон:Нп5 Inc. уже разрабатывает морфолиновые олигонуклеотиды — потенциальные лекарства под названием NeuGene. В настоящее время проходят клинические испытания морфолиновые олигонуклеотиды, которые могут использоваться для лечении миодистрофии Дюшенна у человека^[50].

Примечания

Шаблон:Примечания

Литература

Ссылки

Шаблон:Cite web

Шаблон:Нуклеиновые кислоты Шаблон:Хорошая статья

[1] Шаблон:Статья

[2] Шаблон:Статья

[3] Шаблон:Статья

[RNaseH-4] 4,0 ^4,1 Шаблон:Cite pmid

[Draper-5] 5,0 ^5,1 ^5,2 Шаблон:Cite pmid

[6] Шаблон:Cite pmid

[7] Шаблон:Cite pmid

[Deas-8] 8,0 ^8,1 Шаблон:Cite pmid

[McClorey-9] Шаблон:Cite pmid

[SummertonWeller-10] 10,0 ^10,1 Шаблон:Cite pmid

[11] Шаблон:Cite pmid

[12] Шаблон:Cite pmid

[13] Шаблон:Cite pmid

[14] Шаблон:Cite pmid

[Morcos-15] 15,0 ^15,1 Шаблон:Cite pmid

[Summerton-16] 16,0 ^16,1 Шаблон:Cite pmid

[17] Шаблон:Cite pmid

[18] Шаблон:Cite pmid

[19] Шаблон:Cite pmid

[20] Шаблон:Cite pmid

[21] Шаблон:Cite pmid

[22] Шаблон:Cite pmid

[23] Шаблон:Cite pmid

[24] Шаблон:Cite pmid

[25] Шаблон:Cite pmid

[26] Шаблон:Cite pmid

[27] Шаблон:Cite pmid

[28] Шаблон:Cite pmid

[29] Шаблон:Cite pmid

[BillPrimerZfish-30] 30,0 ^30,1 ^30,2 Шаблон:Cite pmid

[31] Шаблон:Cite pmid

[32] Шаблон:Cite pmid

[33] Шаблон:Cite pmid

[34] Шаблон:Статья

[35] Шаблон:Cite pmid

[36] Шаблон:Cite pmid

[37] Шаблон:Cite pmid

[38] Шаблон:Cite pmid

[39] Шаблон:Cite pmid

[40] Шаблон:Cite pmid

[41] Шаблон:Статья

[42] Шаблон:Cite pmid

[43] Шаблон:Cite pmid

[44] Шаблон:Cite pmid

[45] Шаблон:Cite pmid

[46] Шаблон:Cite pmid

[47] Шаблон:Cite pmid

[FirstVivo-48] Шаблон:Cite pmid

[49] Шаблон:Cite pmid

[50] Шаблон:Cite web

[1]

[2]

[3]

[4]

[5]

[6]

[7]

[8]

[9]

[10]

[11]

[12]

[13]

[14]

[15]

[16]

[17]

[18]

[19]

[20]

[21]

[22]

[23]

[24]

[25]

[26]

[27]

[28]

[29]

[30]

[31]

[32]

[33]

[34]

[35]

[36]

[37]

[38]

[39]

[40]

[41]

[42]

[43]

[44]

[45]

[46]

[47]

[48]

[49]

[50]

Партнерские ресурсы
Криптовалюты	Обмен криптовалют - www.bestchange.ru Криптовалютная биржа CoinEx Криптовалютная биржа Binance HIVE OS - операционная система для майнинга e4pool - Мультивалютный пул для майнинга.
Магазины	AliExpress — глобальная виртуальная (в Интернете) торговая площадка, предоставляющая возможность покупать товары производителей из КНР; computeruniverse.net - Интернет-магазин компьютеров(Промо код 5 Евро на первую покупку:FWWC3ZKQ);
Хостинг	DigitalOcean - американский провайдер облачных инфраструктур, с главным офисом в Нью-Йорке и с центрами обработки данных по всему миру;
Разное	Викиум - Онлайн-тренажер для мозга Like Центр - Центр поддержки и развития предпринимательства. Gamersbay - лучший магазин по бустингу для World of Warcraft. Ноотропы OmniMind N°1 - Усиливает мозговую активность. Повышает мотивацию. Улучшает память. Санкт-Петербургская школа телевидения - это федеральная сеть образовательных центров, которая имеет филиалы в 37 городах России. Lingualeo.com — интерактивный онлайн-сервис для изучения и практики английского языка в увлекательной игровой форме. Junyschool (Джунискул) – международная школа программирования и дизайна для детей и подростков от 5 до 17 лет, где ученики осваивают компьютерную грамотность, развивают алгоритмическое и креативное мышление, изучают основы программирования и компьютерной графики, создают собственные проекты: игры, сайты, программы, приложения, анимации, 3D-модели, монтируют видео. Умназия - Интерактивные онлайн-курсы и тренажеры для развития мышления детей 6-13 лет SkillBox - это один из лидеров российского рынка онлайн-образования. Среди партнеров Skillbox ведущий разработчик сервисного дизайна AIC, медиа-компания Yoola, первое и самое крупное русскоязычное аналитическое агентство Tagline, онлайн-школа дизайна и иллюстрации Bang! Bang! Education, оператор PR-рынка PACO, студия рисования Draw&Go, агентство performance-маркетинга Ingate, scrum-студия Sibirix, имидж-лаборатория Персона. «Нетология» — это университет по подготовке и дополнительному обучению специалистов в области интернет-маркетинга, управления проектами и продуктами, дизайна, Data Science и разработки. В рамках Нетологии студенты получают ценные теоретические знания от лучших экспертов Рунета, выполняют практические задания на отработку полученных навыков, общаются с экспертами и единомышленниками. Познакомиться со всеми продуктами подробнее можно на сайте https://netology.ru, линейка курсов и профессий постоянно обновляется. StudyBay Brazil – это онлайн биржа для португалоговорящих студентов и авторов! Студент получает уникальную работу любого уровня сложности и больше свободного времени, в то время как у автора появляется дополнительный заработок и бесценный опыт. Автор24 — самая большая в России площадка по написанию учебных работ: контрольные и курсовые работы, дипломы, рефераты, решение задач, отчеты по практике, а так же любой другой вид работы. Сервис сотрудничает с более 70 000 авторов. Более 1 000 000 работ уже выполнено. StudyBay – это онлайн биржа для англоязычных студентов и авторов! Студент получает уникальную работу любого уровня сложности и больше свободного времени, в то время как у автора появляется дополнительный заработок и бесценный опыт.