Русская Википедия:Синтез олигонуклеотидов
Синтез олигонуклеотидов — это химический синтез относительно коротких фрагментов нуклеиновых кислот с заданной химической структурой (последовательностью). Метод применяется в современной лабораторной практике для получения олигонуклеотидов нужной последовательности быстрым и недорогим способом.
Наиболее распространённый способ синтеза олигонуклеотидовШаблон:Переход основан на использовании амидофосфитов — строительных блоков, которые являются реакционноспособными производными дезоксирибонуклеозидов (dA, dC, dG, T) или рибонуклеозидов (A, C, G, U) и позволяют синтезировать короткие фрагменты ДНК и РНК соответственноШаблон:Переход. Применяются также и другие амидофосфиты, позволяющие вводить в цепь продукта модифицированные нуклеозиды, различные метки и функциональные группы. В ходе синтеза эти реагенты поочерёдно, в порядке, задаваемом последовательностью целевого продукта, присоединяют к растущей на твердофазном носителе цепиШаблон:Переход. Этот процесс был полностью автоматизирован в конце 1970-х годов и в настоящее время выполняется в специальных синтезаторах, управляемых компьютерами.
После завершения синтеза олигонуклеотид отделяют от носителя, удаляют защитные группы, использовавшиеся во время синтеза и очищают полученный продукт при помощи электрофореза или ВЭЖХШаблон:Переход.
Синтетические олигонуклеотиды находят широкое применение в молекулярной биологии и медицине, например, как антисмысловые олигонуклеотиды, праймеры для секвенирования и амплификации ДНК, зонды для определения комплементарных последовательностей ДНК и РНК, инструменты для нацеленного введения мутаций и сайтов рестрикции, а также для синтеза искусственных генов.
История
В процессе эволюции синтеза олигонуклеотидов было разработано четыре основных метода создания связей между нуклеозидами. Эти методы детально рассмотрены в подробных обзорах литературы[1][2][3].
Ранние работы и современный H-фосфонатный метод
В начале 1950-х годов группа Александра Тодда из Кембриджа заложила основу для H-фосфонатного и фосфотриэфирного методов синтеза олигонуклеотидов[4][5], синтезировав защищённый хлорфосфат 4, введя его в реакцию с 3′-защищённым тимидином 5 и подтвердив структуру полученного защищённого динуклеотида 6 при помощи ферментативного расщепления. Как ни странно, дальнейшая работа в этом направлении в Кембридже не велась (Тодд отмечал в своей автобиографии, что синтез олигонуклеотидов его не привлекал)[1].
Возвращение к работам Тодда произошло только тридцать лет спустя, когда две исследовательские группы адаптировали H-фосфонатную конденсацию к твердофазному синтезу, используя нуклеозидные H-фосфонаты в качестве строительных блоков, а пивалоилхлорид, 2,4,6-триизопропилбензолсульфонилхлорид (TIPS-Cl) и другие соединения — в качестве активаторов[6][7]. Практически метод был организован в виде простого синтетического цикла, состоящего из двух стадий: снятия диметокситритильной защиты и конденсации.
Окисление H-фосфонатной диэфирной связи между нуклеозидами в данном методе проводят после синтеза олигонуклеотидной цепи под действием раствора йода в водном пиридине. В случае необходимости, окисление может проводиться в безводных средах[8]. Метод также позволяет синтезировать тиофосфатные[9] и селенофосфатные[10] аналоги олигонуклеотидов. Окисление тетрахлорметаном в присутствии первичных и вторичных аминов приводит к амидофосфатным аналогам[11][12].
Как правило, 5′-гидроксильная группа во всех 3′-Н-фосфонатах нуклеозидов и аминогруппа в Н-фосфонатах нуклеозидов c основаниями A, G и С защищаются перед использованием в синтезе теми же группами, что и в амидофосфитном методеШаблон:Переход. Однако, защита аминогрупп не является строго обязательной[8][13].
Фосфодиэфирный метод
В 1950-х годах Хар Гобинд Корана и сотрудники разработали фосфодиэфирный метод, в котором 3′-O-ацетилнуклеозид-5′-O-фосфат активировался N,N'-дициклогексилкарбодиимидом (DCC) или п-толуолсульфонилхлоридом (TsCl), а затем вводился в реакцию с 5′-O-защищённым нуклеозидом с образованием динуклеозидмонофосфата[14]. После удаления защитной ацетильной группы в основной среде, проводили дальнейшее удлинение цепи. Пошаговой конденсацией были синтезированы наборы три- и тетрамерных олигонуклеотидов. Кроме того осуществлялась конденсации олигомерных фрагментов с целью получения более длинных олигонуклеотидов[1].
Защита фосфатных групп в фосфодиэфирном синтезе не использовалась, а именно это, по-видимому, приводило к побочным реакциям и снижало выход синтеза. Однако, Корана считал, что постановка защиты на фосфатные группы приведёт к потере главного достоинства олигонуклеотидов — их полиэлектролитной природы, которую, как он полагал, можно эффективно использовать для очистки олигонуклеотидов. Важной находкой Кораны стало использование тритильных защитных групп для защиты 5′-гидроксильных нуклеозидов[1].
Фосфотриэфирный метод
В 1960-х годах группы под руководством Шаблон:Нп5 (Шаблон:Lang-en)[15][16] и К. Риза (Шаблон:Lang-en)[17] разработали фосфотриэфирный метод. Определяющее отличие от фосфодиэфирного подхода состоит в предварительной защите фосфата в реагенте и продукте цианэтильной группой -CH2CH2CN. Это изменение исключило возможность образования олигонуклеотидов с разветвлением у фосфатных групп. Бо́льшая селективность метода позволила использовать более реакционноспособные конденсирующие реагенты и катализаторы[18][19], которые значительно уменьшили продолжительность синтеза. Фосфотриэфирный метод был реализован как в растворе, так и в твердофазном варианте[1].
Данным методом удалось синтезировать два двухцепочечных олигонуклеотида длиной 77 и 104 пары оснований, последовательность которых соответствовала А- и В-цепям инсулина, что впоследствии позволило успешно экспрессировать эти гены[1].
Фосфитный триэфирный метод
В 1970-х годах в практику был введен фосфиттриэфирный метод образования межнуклеозидных связей, в котором были использованы существенно более реакционноспособные нуклеозидные производные на основе P(III), первоначально хлорфосфиты[20]. Позже группа под руководством М. Карузерса (Шаблон:Lang-en) использовала менее агрессивные и более селективные 1H-тетразолидофосфиты и реализовала метод в твердофазном варианте[21]. Вскоре после этого сотрудники из той же группы улучшили метод путём использования в качестве строительных блоков более стабильных нуклеозидных амидофосфитовШаблон:Переход. Замена менее практичной метильной защитной группы фосфата[22][23][24] на более удобную 2-цианэтильную группу[25] дала тот вариант нуклеозидных амидофосфитов, который является стандартом реагентов для синтеза олигонуклеотидов и в настоящее время. Многочисленные дальнейшие усовершенствования методов синтеза мономерных блоков, олигонуклеотидных синтезаторов и протоколов сборки и деблокирования превратили амидофосфитный подход в очень надёжный и производительный метод получения синтетических олигонуклеотидов[26].
Синтез амидофосфитным методом
Строительные блоки
Нуклеозидные амидофосфиты
В 1976 году Летсингер и сотрудники обнаружили, что соединения трёхвалентного фосфора являются гораздо более активными реагентами, чем соответствующие производные пятивалентного фосфора. Роль соединений P(III) стала очевидной после разработки М. Карузерсом N,N-диизопропиламидофосфитных производных нуклеозидов (нуклеозидных амидофосфитов)[1][22], которые и сегодня выполняют роль стандартных строительных блоков в амидофосфитном методе синтеза. Для предотвращения нежелательных побочных реакций функциональные группы амидофосфитов должны быть заблокированы защитными группами. После окончания сборки олигонуклеотидной цепи все защитные группы удаляются, что приводит к целевому олигонуклеотиду. Ниже рассмотрены защитные группы применяемые в стандартных коммерчески доступных нуклеозидных амидофосфитах[27]:
- Гидроксильная группа в 5′-положении защищается 4,4'-диметокситритильной (DMT) защитной группой, удаляемой в кислой среде.
- Тимин и урацил, азотистые основания тимидина и уридина соответственно, не имеют экзоциклических аминогрупп, поэтому не нуждаются в защитных группах. Гуанин имеет экзоциклическую аминогруппу с низкой основностью, поэтому он не вступает в побочные реакции с амидофосфитами в условиях реакции конденсации. Однако, амидофосфитный реагент на основе N2-незащищенного 5′-O-DMT-2′-дезоксигуанозина плохо растворим в ацетонитриле — растворителе, наиболее часто используемом в синтезе олигонуклеотидов. Напротив, N2-защищённые производные того же соединения хорошо растворимы в ацетонитриле, поэтому и применяются гораздо шире. Азотистые основания аденин и цитозин содержат аминогруппы, способные реагировать с амидофосфитами в процессе синтеза, и поэтому для синтеза в стандартных условиях эти группы необходимо защищать. Тем не менее, путём введения в синтетический цикл дополнительных стадий можно добиться использования и незащищённых амидофосфитов dA и dC[28]. Защитные группы на азотистых основаниях должны сохраняться в течение всего синтеза, поэтому используются такие группы, реакционная способность которых противоположна реакционной способности 4,4'-диметокситритильной группы, которая удаляется после каждого цикла. Чаще всего используются два подхода, описанных ниже.
- В первом, стандартном, подходе для защиты аденина и цитозина используется бензоильная защита (Bz), тогда как гуанин защищаются изобутирильной группой (iBu)[29]. Позже для защиты цитозина была предложена ацетильная (Ac) группа, которая может быть удалена аммиаком, или смесью аммиака с метиламином[30].
- Во второй, более мягкой, защитной схеме аденин защищают изобутирильной[31] или феноксиацетильной (PAC)[32] группами. Цитозин содержит ацетильную защитную группу[30], а гуанин защищён 4-изопропилфеноксиацетильной (iPr-PAC)[33] или диметилформамидиновой (dmf)[34] группами. Мягкие защитные группы удаляются легче стандартных, однако, амидофосфиты с данными группами менее стабильны при хранении в растворе.
- Фосфитная группа защищается 2-цианэтильной группой[25]. Присутствие фосфитной защиты обязательно для амидофосфита и новообразованной фосфиттриэфирной группы до окисления последней в фосфотриэфир. В то же время, присутствие защиты на фосфатных группах уже собранного олигонуклеотидного фрагмента не является обязательным для успешного проведения дальнейших циклов конденсации[35].
- В синтезе РНК используются строительные блоки с «дополнительной» 2′-гидроксильной группой, не участвующей в синтезе. Её защищают трет-бутилдиметилсилильной (TBDMS)[36][37][38] или триизопропилсилилоксиметильной (TOM)[39][40] группой. Обе группы удаляются действием фторид-иона.
- Фосфитная группа также содержит диизопропиламинную группу (i-Pr2N), реакционноспособную в кислых условиях. При активации под действием кислотного катализатора эта группа замещается 5′-гидроксильной группой растущей цепи[22].
Ненуклеозидные амидофосфиты
Ненуклеозидные амидофосфиты — это амидофосфитные реагенты, разработанные для введения разнообразных функциональных групп и меток в концевое положение олигонуклеотида или между нуклеотидными остатками посреди последовательности. Чтобы быть пригодным для введения в середину цепи, амидофосфит должен содержать, по крайней мере, две гидроксильные группы, одна из которых защищается DMT-группой, а вторая несёт реакционноспособную амидофосфитную группировку.
Ненуклеозидные амидофосфиты применяются для введения в олигонуклеотид различных групп, которые не встречаются в природных нуклеозидах. Синтезирован широкий спектр подобных реагентов, служащих, например, для введения 5′-фосфата[41], аминогруппы[42], меркаптогруппы[43], альдегидной[44] и карбоксильной[45] групп, алкиновых фрагментов[46], флуоресцентных красителей[47] и тушителей, гидрофильных[48] и гидрофобных[49] модификаций, биотина[50] и др.
Синтетический цикл
Синтез олигонуклеотидов проводится путём пошаговой конденсации строительных блоков к 5′-концу растущей цепи, пока не будет собрана целевая последовательность. Протекание побочных реакций накладывает ограничение на длину синтезируемого олигонуклеотида (до 200 нуклеотидных остатков), поскольку число ошибок накапливается с увеличением длины целевого продукта[26]. Совокупность операций, необходимых для удлинения цепи на один нуклеотидный остаток, называется циклом синтеза и состоит из четырёх химических реакций.
Стадия 1: Удаление тритильной защиты
Защитная группа DMT удаляется раствором кислоты, например, 2%-ой трихлоруксусной кислотой или 3%-ой дихлоруксусной кислотой в инертном растворителе (хлористом метилене или толуоле). Образующийся диметокситритильный катион оранжевого цвета вымывается из системы. В результате образуется закреплённый на твердофазном носителе предшественник олигонуклеотида со свободной 5′-гидроксильной группой. Проведение процесса в течение более длительного времени или с использованием более концентрированных растворов кислоты приводит к побочной реакции депуринизации — отщепления пуриновых оснований от остатка рибозы.
Стадия 2: Конденсация
Раствор нуклеозидного амидофосфита (0,02—0,2 М) или смеси нескольких амидофосфитов в ацетонитриле активируют 0,2—0,7 М раствором кислотного катализатора на основе азола: 1H-тетразола, 2-этилтиотетразола[51], 2-бензилтиотетразола[52], 4,5-дицианимидазола[53] и др. Смешение компонентов происходит в коммуникационных линиях синтезатора в процессе доставки реагентов в реактор, содержащий твердофазный носитель. Активированный амидофосфит в 1,5—20-кратном избытке вводится во взаимодействие с 5′-гидроксильной группой, образуя фосфитную триэфирную связь. Конденсация амидофосфитов 2′-дезоксинуклеозидов протекает очень быстро и в небольшом масштабе занимает, как правило, около 20 секунд. Пространственно-затрудненные амидофосфиты рибонуклеозидов реагируют значительно медленнее (5—15 мин)[54][55][56][57]. Реакция весьма чувствительна к присутствию воды, особенно при использовании разбавленных растворов амидофосфитов, поэтому она проводится в безводном растворителе, обычно, ацетонитриле. При увеличении масштабов синтеза используют меньшие избытки и более концентрированные растворы амидофосфитов. После завершения реакции избыток реагентов и побочные продукты удаляются из реактора промыванием.
Стадия 3: Кэпирование
Кэпирование проводится путём обработки твердофазного носителя смесью уксусного ангидрида и 1-метилимидазола (реже — DMAP) в качестве катализатора. В рамках амидофосфитного синтеза эта стадия служит двум целям:
- После завершения стадии конденсации небольшая доля 5′-гидроксильных групп (0,1—1 %) остаётся непрореагировавшими и должна быть выведена из процесса дальнейшего удлинения цепи, чтобы предотвратить образование олигонуклеотидов с недостающими нуклеотидными остатками внутри цепи. С этой целью оставшиеся гидроксильные группы защищаются ацетильными группами, устойчивыми к действию растворов кислот, используемых для снятия DMT-защиты.
- Сообщалось также, что амидофосфиты, активированные 1H-тетразолом, с невысоким выходом реагируют с кислородом карбонильной группы в O6-положении гуанозина[58]. При окислении смесью йода с водой этот побочный продукт претерпевает отщепление пуринового основания. Образующиеся апуриновые сайты легко гидролизуются в ходе конечного снятия защитных групп олигонуклеотида, что приводит к образованию двух более коротких олигонуклеотидов и уменьшению выхода целевого продукта. O6-модификации быстро удаляются под действием кэпирующего реагента, если кэпирование проводится перед стадией окисления.
Стадия 4: Окисление
Полученная в результате конденсации межнуклеозидная трехкоординированная фосфитная группа не является природной и обладает ограниченной стабильностью в условиях синтеза. Обработка носителя йодом и водой в присутствии слабого основания (пиридин, 2,6-лутидин или коллидин) окисляет фосфит в фосфотриэфир, предшественник природной фосфодиэфирной межнуклеозидной связи. Окисление можно проводить и в безводных условиях с использованием трет-бутилгидропероксида[59] или более удобного реагента, (1S)-(+)-(10-камфорсульфонил)оксазиридина[60].
Твердофазные носители
В процессе всего твердофазного синтеза олигонуклеотид ковалентно связан с твердофазным носителем через 3′-гидроксильную группу. Носитель обычно помещается в колонки, размер которых зависит от масштаба синтеза. В последние 10 лет получили широкое распространение высокопроизводительные олигонуклеотидные синтезаторы, в которых носитель помещается в лунки планшета (96 или 384 лунок на планшет)[61]. После окончания синтеза олигонуклеотид отщепляется от носителя и переходит в раствор.
Материал носителя
| Размер пор CPG, Å[62] | Загрузка, мкмоль/г |
Длина продукта, оснований |
|---|---|---|
| 500 | 80—90 | <50 |
| 1000 | 50—60 | 80 |
| 1500 | 35—45 | 100 |
| 2000 | 20—30 | 150 |
| 3000 | 200 |
В отличие от органического твердофазного синтеза и пептидного синтеза, синтез олигонуклеотидов лучше протекает на ненабухающих или слабонабухающих твердофазных носителях. Наиболее часто употребимыми носителями являются стекло с контролируемым размером пор (Шаблон:Lang-en, CPG) и макропористый полистирол (MPPS)[63].
- Главной характеристикой CPG является диаметр пор, который может быть равным от 70 до 4000 Å, при этом поры весьма однородны по размеру (отклонение составляет ±10 % для 80 % пор). Для того, чтобы сделать такой носитель пригодным для синтеза, его обрабатывают Шаблон:Нп5 (APTES), получая аминопропильное CPG. Также часто используются CPG c удлинённым спейсером (Шаблон:Lang-en, LCAA CPG)[63]. От размера пор зависят две ключевые характеристики синтеза: масштаб, определяемый числом активных функциональных групп на единицу массы носителя, и максимальная длина синтезируемого олигонуклеотида. Данные по наиболее распространёнными носителям CPG приведены в таблице[62].
- Также в синтезе олигонуклеотидов применяется макропористый полистирол, получаемый сополимеризацией стирола и дивинилбензола, с введённой аминометильной модификацией. Такой полистирол позволяет синтезировать олигонуклеотиды длиной менее 40—50 оснований. Для небольших синтезов можно использовать полистирольный носитель с загрузкой от 10 до 45 мкмоль/г. Для синтезов в масштабе 25—100 мкмоль используется полистирол с загрузкой 200 до 400 мкмоль/г. Наконец, полистирол больше, чем CPG, подходит для крупномасштабных синтезов (более 100 мкмоль)[62].
Химия линкера
Для нужд олигонуклеотидного синтеза к аминогруппам аминопропильного CPG, LCAA CPG или аминометильного MPPS ковалентно присоединяют нуклеозидные сукцинаты или ненуклеозидные линкеры. Обычно используют три различных типа носителей.
- Нуклеозидные носители. В исторически первом подходе синтез олигонуклеотида проводится на носителе, к которому заранее через фрагмент янтарной кислоты ковалентно присоединён 3′-концевой, стартовый, нуклеозид. Соответственно, синтез начинается с присоединения амидофосфита, соответствующего не первому, а второму нуклеотиду, считая с 3′-конца. Недостатком такого носителя является то, что перед началом синтеза необходимо выбрать вариант нуклеозидного носителя, соответствующий 3′-концевому нуклеозиду в синтезируемом олигонуклеотиде, что уменьшает производительность синтетического процесса и увеличивает вероятность человеческой ошибки[64]. Предложены также альтернативные твердофазные носители со спейсером на основе дигликолевой и щавелевой кислот для более быстрого отделения продукта от носителя[63].
- Универсальные носители. В данном методе синтез начинается с универсального носителя, к которому присоединён ненуклеозидный линкер[65]. Амидофосфит, соответствующий 3′-терминальному нуклеозиду, присоединяют к универсальному носителю по стандартной методике в ходе первого синтетического цикла. После этого продолжают сборку требуемой последовательности, а затем олигонуклеотид отщепляют с поверхности носителя. Преимущество данного подхода заключается в том, что во всех синтезах независимо от того, какую последовательность необходимо синтезировать, может быть использован единственный универсальный носитель[64].
- Специальные носители используются для присоединения некоторой функциональной или репортерной группы к 3′-положению синтетических олигонуклеотидов. Коммерчески доступны носители для введения аминогрупп[66], меркаптогрупп[67], тушителей флуоресценции[68] и др.
Тиофосфатные олигонуклеотиды и их синтез
Тиофосфатные олигонуклеотиды — это модифицированные олигонуклеотиды, в которых один из атомов кислорода в фосфатном остатке замещен на атом серы. Широко используются только те тиофосфаты, в которых сера не является связующим звеном между нуклеозидным остатком и атомом фосфора. В этом случае замена кислорода на серу приводит к образованию нового центра хиральности на атоме P(V), поэтому в простейшем случае динуклеотида образуются SP- и RP-диастереомеры. В n-мерном олигонуклеотиде, в котором все (n-1) межнуклеотидных связей являются тиофосфатными, число диастереомеров составляет 2(n-1). Будучи неприродными аналогами нуклеиновых кислот, олигонуклеотидные тиофосфаты значительно более устойчивы к гидролизу нуклеазами, классом ферментов, расщепляющих нуклеиновые кислоты путём гидролиза P-O-связи фосфодиэфирного мостика. Это свойство определяет использование тиофосфатов в качестве антисмысловых олигонуклеотидов в приложениях in vivo и in vitro, где неизбежно воздействие нуклеаз. Подобным образом, чтобы увеличить стабильность малых интерферирующих РНК, часто вводят, по крайней мере, одну тиофосфатную связь в 3′-положение смысловой и антисмысловой цепи. В оптически чистых олигонуклеотидных тиофосфатах диастереомеры, в которых все фосфорные центры имеют SP-конфигурацию, более устойчивы к ферментативному гидролизу, чем их RP-аналоги. Однако, синтез оптически чистых тиофосфатов сложен[69][70].
Синтез олигонуклеотидных тиофосфатов аналогичен синтезу природных олигонуклеотидов. Различие заключается в том, что стадия окисления заменяется реакцией сульфурирования. Для введения серы применяются следующие коммерчески доступные реагенты:
- 3-(Диметиламинометилиденамино)-3H-1,2,4-дитиазол-3-тион (DDTT) обеспечивает высокую скорость сульфурирования и обладает стабильностью в растворе[71].
- Реагент Бокажа (Шаблон:Lang-en) имеет более высокую растворимость в ацетонитриле и обеспечивает протекание реакции за более короткое время. Однако, он имеет ограниченную стабильность в растворе и менее эффективен при сульфурировании связей РНК[72].
- N,N,N',N'-Тетраэтилтиурамдисульфид (TETD) растворим в ацетонитриле, однако, реакция сульфурирования межнуклеозидной связи ДНК занимает 15 мин, что в 10 раз медленнее, чем в случае двух предыдущих соединений[73].
Разработаны также другие сульфурирующие реагенты[74].
В синтезе тиофосфатных олигонуклеотидов стадия кэпирования проводится после сульфурирования. Если кэпирования проводить перед сульфурированием, то после кэпирования твердофазный носитель может содержать остаточные количества уксусного ангидрида и 1-метилимидазола. Кэпирующая смесь затрудняет реакцию переноса серы, что приводит к образованию тиофосфатных олигонуклеотидов с повышенным содержанием фосфатных звеньев. В таком случае рекомендуют проводить кэпирование после реакции сульфурирования[71].
Автоматизация
Ранее олигонуклеотидный синтез проводился вручную в растворе или на твёрдой фазе. Для твердофазного синтеза были приспособлены различные устройства на основе шприцев с пористыми мембранами или миниатюрных стеклянных фильтров, позволяющие промывать твердофазный носитель растворами реагентов и удалять их при помощи вакуума[76].
В настоящее время твердофазный синтез проводится автоматически в олигонуклеотидных синтезаторах, управляемых компьютерами. Данные приборы состоят из серии клапанов, соединённых с ёмкостями для реагентов, а также соленоидами, которые открывают или закрывают тот или иной клапан. В свою очередь, соленоиды управляются компьютером, выполняющим программу синтеза. Когда клапан открыт, через колонку, содержащую твердофазный носитель, в течение времени, задаваемого программой, прокачивается определённый реагент. Время и последовательность подачи реагентов постоянны для каждого синтетического цикла; переменным является лишь мономерный реагент, который должен конденсироваться в данном цикле. Его выбор также производится программой в соответствии с заданной олигонуклеотидной последовательностью[77].
Синтез может быть реализован в колоночном, планшетном или чиповом формате. Колоночный метод синтеза пригоден для исследований, или крупномасштабного синтеза этих полимеров, где не требуется высокая производительность их синтеза. Планшетный формат разработан специально для высокопроизводительного синтеза в малом масштабе для удовлетворения растущей потребности производства и науки в синтетических олигонуклеотидах. Коммерчески доступны различные виды синтезаторов[78][79][80].
Пост-синтетическая обработка
Для получения целевого олигонуклеотида необходимо удалить все защитные группы олигонуклеотида:
- 5′-концевую DMT-группу;
- ацильные защитные группы на азотистых основаниях;
- 2-цианэтильные группы, защищающие межнуклеозидные фосфатные группы.
5′-DMT-группа, как правило, удаляется раствором кислоты ещё в ходе автоматического синтеза. Отщепление олигонуклеотида от носителя, удаление защитных групп оснований и цианэтильных защитных групп обычно происходит одновременно под действием неорганических оснований или аминов. Обычно для этих целей применяют водный аммиак, раствор метиламина, их смеси[30], газообразный аммиак или метиламин[81], реже растворами других первичных аминов и щелочей при комнатной либо повышенной температуре. Такая обработка удаляет все защитные группы с 2′-дезоксиолигонуклеотидов, давая раствор конечного продукта. В случае 2′-O-силилзащищённых олигорибонуклеотидов добавляется стадия удаления силильных защитных групп под действием фторид-иона[82].
Применение данного метода ограничено тем, что при такой обработке в качестве побочного продукта образуется акрилонитрил. В условиях снятия защитных групп акрилонитрил может алкилировать азотистые основания, в основном, N3-положение тимина и урацила с образованием 2-цианэтильных производных по реакции Михаэля. Образования этих побочных продуктов можно избежать обработкой олигонуклеотидов, связанных с твердофазным носителем, растворами оснований в органическом растворителе, например, 50 % триэтиламином в ацетонитриле[83] или 10 % диэтиламином в ацетонитриле[84].
Незащищённый олигонуклеотид может использоваться без дальнейшей очистки или подвергаться дополнительной очистке одним из следующих методов[85].
- Наиболее грубым методом очистки олигонуклеотида является обессоливание — отделение низкомолекулярных примесей, образовавшихся при удалении защитных групп (бензамид, изобутирамид, ацетат аммония и др.). Для больших количеств олигонуклеотидов обессоливание удобно проводить осаждением в этанол: при этом продукт выпадает в осадок, а примеси и — в некоторых случаях — более короткие олигонуклеотиды остаются в растворе. Для малых количеств применяется гель-фильтрацияШаблон:Sfn.
- Очистка от укороченных олигонуклеотидов может быть эффективно произведена при помощи электрофореза в полиакриламидном геле, который основан на разделении олигонуклеотидов по размеру вследствие их различной подвижности в геле под действием электрического поля. После проведения электрофореза по поглощению ультрафиолетового излучения определяют фрагмент геля, в которой находится целевой олигонуклеотид, эту часть вырезают и выделяют очищенный олигонуклеотид вымачиванием или электроэлюциейШаблон:Sfn.
- Наиболее полная очистка достигается при использовании высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). В данном методе разделение основано на гидрофобном (обращённофазовая ВЭЖХ) или зарядовом (ионообменная ВЭЖХ) взаимодействии олигонуклеотидов с сорбентом. Сила этого взаимодействия влияет на порядок и время элюции продукта из хроматографической колонки, что позволяет достаточно эффективно разделять продукты различной длины. Часто применяют альтернативный подход, при котором 5′-DMT-группа олигонуклеотида перед очисткой не удаляется. В этом случае за счёт присутствия гидрофобной защитной группы его гидрофобность и сила взаимодействия с гидрофобным сорбентом значительно увеличиваются, а хроматографическая подвижность снижается, что делает выделение продукта более эффективным. DMT-группа затем удаляется в кислой среде, а раствор упаривают и обессоливаютШаблон:Sfn.
Характеризация
Как и в случае других органических веществ, целесообразно охарактеризовать олигонуклеотид после его получения. В более сложных случаях (исследование или крупномасштабный синтез) это делают дважды: после снятия защитных групп и после очистки. Несмотря на то, что наиболее корректным подходом к характеризации олигонуклеотида является секвенирование, относительно недорогая и рутинная процедура, экономические соображения препятствуют его введению в производство олигонуклеотидов. В ежедневной практике достаточно получить молекулярную массу олигонуклеотида путём регистрации его масс-спектра. Используется два метода масс-спектрометрии: электроспрей и МАЛДИ масс-спектрометрия. Для получения информативного спектра важно заменить все ионы металлов, которые могут присутствовать в образце, на ионы аммония или триалкиламмоиния.
- При ионизации электроспреем олигонуклеотид даёт набор ионов, которые соответствуют разной степени ионизации соединения. Олигонуклеотид с молекулярной массой М даёт ионы с массами (М — nH)/n, где М — молекулярная масса олигонуклеотида в кислотной форме (все отрицательные заряды фосфодиэфирных связей компенсированы наличием протонов), n — это степень ионизации, Н — атомная масса атома водорода (1 Да). Наиболее полезны для характеризации ионы с n от 2 до 5. Программное обеспечение, поставляемое с современными приборами, способно автоматически проводить поиск пиков ионов, принадлежащих определённому олигонуклеотиду, и вычислять молекулярную массу последнего.
- Для получения более детальной информации о примесях в олигонуклеотиде используются аналитические методы, комбинирующие ВЭЖХ и масс-спектрометрию[86] или капиллярный электрофорез и масс-спектрометрию[87].
См. также
Примечания
Литература
Основные оригинальные работы
Обзоры
Методы
Ссылки
- ↑ 1,0 1,1 1,2 1,3 1,4 1,5 1,6 Шаблон:Статья
- ↑ Шаблон:Книга
- ↑ Шаблон:Книга
- ↑ Шаблон:Статья
- ↑ Шаблон:Статья
- ↑ Шаблон:Статья
- ↑ Шаблон:Статья
- ↑ 8,0 8,1 Шаблон:Статья
- ↑ Шаблон:Статья
- ↑ Шаблон:Статья
- ↑ Шаблон:Статья
- ↑ Шаблон:Статья
- ↑ Шаблон:Статья
- ↑ Шаблон:Статья
- ↑ Шаблон:Статья
- ↑ Шаблон:Статья
- ↑ Шаблон:Статья
- ↑ Шаблон:Статья
- ↑ Шаблон:Статья
- ↑ Шаблон:Статья
- ↑ Шаблон:Статья
- ↑ 22,0 22,1 22,2 Шаблон:Статья
- ↑ Шаблон:Статья
- ↑ Шаблон:Статья
- ↑ 25,0 25,1 Шаблон:Статья
- ↑ 26,0 26,1 Шаблон:Статья
- ↑ Шаблон:Cite web
- ↑ Шаблон:Статья
- ↑ Шаблон:Статья
- ↑ 30,0 30,1 30,2 Шаблон:Статья
- ↑ Шаблон:Статья
- ↑ Шаблон:Статья
- ↑ Шаблон:Статья
- ↑ Шаблон:Статья
- ↑ Шаблон:Статья
- ↑ Шаблон:Статья
- ↑ Шаблон:Статья
- ↑ Шаблон:Статья
- ↑ Шаблон:Статья
- ↑ Шаблон:Статья
- ↑ Шаблон:Статья
- ↑ Шаблон:Статья
- ↑ Шаблон:Статья
- ↑ Шаблон:Статья
- ↑ Шаблон:Статья
- ↑ Шаблон:Статья
- ↑ Шаблон:Статья
- ↑ Шаблон:Статья
- ↑ Шаблон:Статья
- ↑ Шаблон:Статья
- ↑ Шаблон:Статья
- ↑ Шаблон:Статья
- ↑ Шаблон:Статья
- ↑ Шаблон:Статья
- ↑ Шаблон:Статья
- ↑ Шаблон:Статья
- ↑ Шаблон:Статья
- ↑ Шаблон:Статья
- ↑ Шаблон:Статья
- ↑ Шаблон:Cite web
- ↑ Шаблон:Cite web
- ↑ 62,0 62,1 62,2 Шаблон:Книга
- ↑ 63,0 63,1 63,2 Шаблон:Книга
- ↑ 64,0 64,1 Шаблон:Статья
- ↑ Шаблон:Статья
- ↑ Шаблон:Статья
- ↑ Шаблон:Cite web
- ↑ Шаблон:Cite web
- ↑ Шаблон:Статья
- ↑ Шаблон:Статья
- ↑ 71,0 71,1 Шаблон:Статья
- ↑ Шаблон:Статья
- ↑ Шаблон:Статья
- ↑ Шаблон:Статья
- ↑ Шаблон:Статья
- ↑ Шаблон:Статья
- ↑ Шаблон:Статья
- ↑ Шаблон:Cite web
- ↑ Шаблон:Cite web
- ↑ Шаблон:Cite web
- ↑ Шаблон:Статья
- ↑ Шаблон:Статья
- ↑ Шаблон:Статья
- ↑ Шаблон:Cite web
- ↑ Шаблон:Cite web
- ↑ Шаблон:Статья
- ↑ Шаблон:Книга
