Лодка совершила 6 боевых походов. Потопила 25 судов суммарным водоизмещением 135 614 брт, повредила 4 судна суммарным водоизмещением 17 229 брт, одно судно после повреждений не восстанавливалось (2 205 брт). Участвовала в нападении на североатлантические конвои OA-204, HX-72, SC-7, НХ-79, SC-11, OB-256.
U-100 была потоплена 17 марта1941 года к юго-востоку от Исландии, примерные координаты Шаблон:Coord, после тарана и глубинной бомбардировки с британских эсминцев HMS Walker и HMS Vanoc. 38 человек погибли, шестеро спаслись. U-100 стала первой лодкой, потопленной в результате применения радара: HMS Vanoc обнаружил её, скрывающуюся в надводном положении под покровом облачной ночи, которая ранее всегда обеспечивала защиту субмарин от обнаружения.
17 августа 1940 года U-100 сразу после обнаружения конвоя была атакована эсминцем, заставившим её погрузиться и сбросившим 7-8 глубинных бомб. Так как гидрофоны на лодке не работали, то местоположение конвоя было утеряно.
22 сентября 1940 года после успешной атаки на конвой HX-72 U-100 выпустила последнюю торпеду по транспорту Putney Hill, но промахнулась и была отогнана тремя выстрелами из его корабельного орудия.
21 октября 1940 года во время атаки на конвой HX-79 лодка выпустила торпеду по танкеру, но промахнулась и была им обстреляна. Повреждений не было.
23 ноября 1940 года после успешной атаки на конвой SC-11 эскортный эсминец артогнём заставил лодку погрузиться а затем атаковал её глубинными бомбами, тем самым выведя из строя её гидрофон.